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技巧分享:免疫電鏡測試的樣本制備要點(diǎn)
來源: 時間:2024-08-02 09:30:35 瀏覽:1573次

技巧分享:免疫電鏡測試的樣本制備要點(diǎn)

 

免疫電鏡測試(Immunoelectron Microscopy,簡稱IEM)是一種高精度的實(shí)驗技術(shù),結(jié)合了電子顯微術(shù)和免疫標(biāo)記技術(shù),用于在納米級別觀察細(xì)胞、組織及生物大分子的超微結(jié)構(gòu);該技術(shù)因其高分辨率和強(qiáng)大的穿透力,在生命科學(xué)研究中扮演著重要角色。

以下將詳細(xì)介紹免疫電鏡測試的樣本制備要點(diǎn):

一、樣本的選擇與固定

1. 樣本選擇:選擇新鮮、無污染的樣本是成功制備免疫電鏡樣本的前提;對于不同類型的樣本,如細(xì)胞、組織切片或病毒顆粒,需采用不同的處理方法。

2. 固定劑的選擇:常用的固定劑有戊二醛和多聚甲醛;戊二醛適用于固定細(xì)胞和組織的超微結(jié)構(gòu),多聚甲醛則更適用于抗原定位。

3. 固定過程:固定時需注意固定劑的濃度、溫度和固定時間;通常,4%戊二醛在4°C下固定過夜效果最佳。

二、脫水與滲透

1. 脫水:脫水是樣本制備的關(guān)鍵步驟,通常使用乙醇或丙酮系列進(jìn)行脫水;每級脫水時間不宜過長,以免樣本變形。

2. 滲透:滲透劑常用環(huán)氧樹脂或聚二甲基硅氧烷(PDMS;滲透過程中需注意溫度和時間,確保樹脂充分滲透到樣本內(nèi)部。

三、包埋與切片

1. 包埋:將滲透好的樣本包埋在環(huán)氧樹脂中,然后進(jìn)行聚合;聚合過程中需控制溫度和時間,以保證樹脂充分聚合。

2. 切片:使用超薄切片機(jī)切取50-70nm的切片,切片應(yīng)無皺褶、無刀痕。

四、免疫標(biāo)記

1. 抗體選擇:選擇特異性強(qiáng)、親和力高的抗體是免疫標(biāo)記成功的關(guān)鍵;一抗和二抗需經(jīng)過驗證,確保其可靠性。

2. 標(biāo)記方法:常用的免疫標(biāo)記方法有免疫金標(biāo)記和免疫鐵標(biāo)記;免疫金標(biāo)記具有更高的分辨率和靈敏度。

3. 標(biāo)記過程:標(biāo)記過程中需注意抗體稀釋度、孵育時間和溫度;通常,4°C下孵育過夜可獲得較好效果。

五、后處理與觀察

1. 后處理:免疫標(biāo)記后的切片需進(jìn)行后處理,如清洗、干燥和染色;常用的染色劑有醋酸鈾和檸檬酸鉛。

2. 觀察:將處理好的切片置于透射電鏡下觀察;觀察時需調(diào)整電壓、電流和聚焦,以獲得清晰的圖像。

六、常見問題與解決方法

1. 樣本脫落:可能由于脫水、滲透不充分或切片過厚;解決方法為優(yōu)化脫水、滲透步驟,切取適當(dāng)厚度的切片。

2. 免疫標(biāo)記不清晰:可能由于抗體濃度不當(dāng)、孵育時間不足或樣本固定不良;調(diào)整抗體濃度、延長孵育時間或優(yōu)化固定步驟可改善。

3. 背景染色過深:可能由于染色時間過長或染色劑濃度過高;適當(dāng)縮短染色時間或降低染色劑濃度可減輕背景染色。

4. 切片皺褶或撕裂:可能由于切片過厚、刀片不鋒利或操作不當(dāng);切取適當(dāng)厚度的切片,確保刀片鋒利,操作時輕柔、穩(wěn)定。

 

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全部 3小時前 四川
文字是人類用符號記錄表達(dá)信息以傳之久遠(yuǎn)的方式和工具?,F(xiàn)代文字大多是記錄語言的工具。人類往往先有口頭的語言后產(chǎn)生書面文字,很多小語種,有語言但沒有文字。文字的不同體現(xiàn)了國家和民族的書面表達(dá)的方式和思維不同。文字使人類進(jìn)入有歷史記錄的文明社會。
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