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WB實驗中的轉膜與抗體結合步驟詳解
來源: 時間:2024-01-08 09:59:01 瀏覽:2619次

WB實驗中的轉膜與抗體結合步驟詳解

 

蛋白質免疫印跡(Western blot,WB是一種檢測蛋白質表達水平和分子量的技術,WB實驗包括樣品制備、SDS-PAGE電泳、轉膜、抗體結合及顯色等多個步驟。


一、轉膜

轉膜是將SDS-PAGE電泳分離后的蛋白質轉移到固定在固相支持物上的過程,轉膜方法有向上毛細管轉移、向下毛細管轉移、電轉移和真空轉移等;固相支持物主要有硝酸纖維素膜和尼龍膜,硝酸纖維素膜是非共價結合,易脆,而尼龍膜是帶正電荷的,高強度,不易破損,具有較大的DNA結合容量,在轉膜過程中,需要將分離膠上的蛋白質完全轉移到膜上,以便后續(xù)的抗體結合和檢測。

二、抗體結合

抗體結合是WB實驗的核心步驟,主要包括一抗孵育、洗滌、二抗孵育和洗滌等過程。

1. 一抗孵育:將特異性一抗添加到轉膜后的膜上,孵育過程中一抗與目標蛋白質發(fā)生結合,一抗的濃度和孵育時間需要根據實驗需求進行調整;一般情況下,一抗的濃度在1:1000-1:10000之間,孵育時間為1-2小時,在孵育過程中,需要保持膜的濕潤,可以使用封閉液或抗體稀釋液進行濕潤。

2. 洗滌:用緩沖液(如TBST)反復洗滌膜上未結合的一抗,洗滌的次數和時間需要根據實驗情況進行調整,一般洗滌3-5次,每次5-10分鐘;洗滌的目的是去除未結合的一抗,避免后續(xù)的顯色反應受到干擾。

3. 二抗孵育:將與一抗匹配的二抗加入到膜上,孵育過程中二抗與一抗結合,二抗的濃度和孵育時間也需要根據實驗需求進行調整;一般情況下,二抗的濃度在1:1000-1:10000之間,孵育時間為1-2小時,同樣需要保持膜的濕潤。

4. 洗滌:用緩沖液(如TBST)反復洗滌膜上未結合的二抗;洗滌的次數和時間需要根據實驗情況進行調整,一般洗滌3-5次,每次5-10分鐘。

三、注意事項

1. 在轉膜過程中,需要控制好轉膜電壓和時間,以及膜的濕度和尺寸,避免影響蛋白質的轉移效率。

2. 在抗體結合過程中,需要注意一抗和二抗的濃度和孵育時間,避免過度或不足結合。

3. 洗滌步驟是去除未結合抗體的重要環(huán)節(jié),需要充分洗滌,避免背景雜亂。

4. 實驗過程中需要保持膜的濕潤,避免膜干燥影響抗體結合。

5. 在顯色過程中,需要均勻涂抹ECL顯色液,避免顯色不均。

 

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全部 3小時前 四川
文字是人類用符號記錄表達信息以傳之久遠的方式和工具?,F代文字大多是記錄語言的工具。人類往往先有口頭的語言后產生書面文字,很多小語種,有語言但沒有文字。文字的不同體現了國家和民族的書面表達的方式和思維不同。文字使人類進入有歷史記錄的文明社會。
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