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蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)的步驟講解及結(jié)果分析
來(lái)源: 時(shí)間:2023-09-15 16:30:23 瀏覽:8854次

蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)步驟講解及結(jié)果分析


蛋白免疫印跡(Western blot)是一種常用的蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù),能夠確定目標(biāo)蛋白的存在、濃度和鑒定其分子量等特征。本文將詳細(xì)介紹蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)的步驟,并提供結(jié)果分析的指導(dǎo)。

 

 

 

實(shí)驗(yàn)步驟:

一.樣品制備:

蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)的第一步是樣品制備。通常,您可以從細(xì)胞培養(yǎng)物、動(dòng)物組織或微生物培養(yǎng)物等樣品中收集蛋白質(zhì)。在此過(guò)程中,您需要避免蛋白質(zhì)的降解和失活。

以下是一般的樣品制備步驟:

a. 收集細(xì)胞或組織:使用適當(dāng)?shù)木彌_液洗滌細(xì)胞或組織,以去除雜質(zhì)和外部污染物。

b. 細(xì)胞破碎:加入蛋白提取緩沖液(含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑),破壞細(xì)胞膜和核膜,釋放蛋白質(zhì)。

c. 離心:將細(xì)胞裂解液或組織裂解液進(jìn)行離心,去除細(xì)胞碎片和核酸等雜質(zhì)。

d. 收集上清液:將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中,以去除未溶解的固體。

 

二.蛋白質(zhì)濃度測(cè)定:

在進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)前,您需要確定蛋白質(zhì)的濃度,以便加載相同的蛋白質(zhì)量進(jìn)行電泳分離。有幾種方法可用于測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,如BCA法或Bradford法。

a. BCA法(雙硫鍵還原法):首先,準(zhǔn)備一系列蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液,使用乙醇胺胸腺嘧啶(BCA)試劑與蛋白質(zhì)反應(yīng),生成可測(cè)定光密度的復(fù)合物。

b. Bradford法:該方法使用考馬斯亮藍(lán)G-250試劑,該試劑與蛋白質(zhì)結(jié)合形成深藍(lán)色物質(zhì),測(cè)量其吸光度。

 

三.SDS-PAGE電泳:

SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)是一種將蛋白質(zhì)按照分子量大小進(jìn)行分離的常見(jiàn)方法。以下是簡(jiǎn)要的步驟:

a. 準(zhǔn)備凝膠:根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的聚丙烯酰胺凝膠濃度和孔隙度。通常使用10%至15%的凝膠。

b. 配制電泳緩沖液:根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)操作程序制備Tris-緩沖溶液,加入適量的SDS和硫酸銨,調(diào)整pH值。將電泳緩沖液加入電泳槽中。

c. 加載樣品:將樣品蛋白質(zhì)與加載緩沖液混合,加熱至95°C,使之變性。然后,將樣品加載到凝膠孔中。

d. 電泳:將凝膠浸入電泳槽中,將電泳槽兩端連接到電源,施加適當(dāng)?shù)碾妷菏沟鞍踪|(zhì)沿凝膠電泳。

e. 停止電泳:當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)移動(dòng)到合適位置或接近凝膠底部時(shí),停止電泳。

f. 凝膠染色:使用染色劑(如Coomassie藍(lán)染液)對(duì)凝膠進(jìn)行染色,以顯示蛋白質(zhì)帶狀。

g. 存儲(chǔ)凝膠:將凝膠轉(zhuǎn)移到顯影儀或圖像記錄系統(tǒng)中,記錄凝膠圖像以備后續(xù)分析使用。

 

四.轉(zhuǎn)膜:

轉(zhuǎn)膜是將凝膠上的蛋白質(zhì)遷移到膜上的一個(gè)步驟,以便進(jìn)行抗體的探針檢測(cè)。常用的膜材料有聚偏氟乙烯(PVDF)和硝酸纖維素(NC)。以下是轉(zhuǎn)膜步驟:

a. 準(zhǔn)備膜:切割適當(dāng)大小的膜,并將其在轉(zhuǎn)膜緩沖液中濕潤(rùn)。

b. 電泳后處理:取出凝膠,將其在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡一段時(shí)間(通常為10-15分鐘),使蛋白質(zhì)遷移到膜上。

c. 轉(zhuǎn)膜裝置組裝:將濕潤(rùn)的膜放在轉(zhuǎn)膜裝置上,層疊在凝膠上。確保膜與凝膠之間沒(méi)有氣泡。

d. 轉(zhuǎn)膜操作:將轉(zhuǎn)膜裝置組裝到轉(zhuǎn)膜槽中,添加足夠的轉(zhuǎn)膜緩沖液,使其覆蓋整個(gè)膜和凝膠。連接上正負(fù)電極,施加適當(dāng)?shù)碾妷?,進(jìn)行轉(zhuǎn)膜操作。

e. 轉(zhuǎn)膜結(jié)束:當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)完全轉(zhuǎn)移到膜上后,停止轉(zhuǎn)膜操作。取出膜并進(jìn)行后續(xù)的處理。

 

五.阻斷:

在進(jìn)行抗體結(jié)合之前,需要對(duì)轉(zhuǎn)膜膜進(jìn)行阻斷,以避免非特異性結(jié)合和減少背景信號(hào)。一般會(huì)使用牛血清白蛋白(BSA)或脫脂奶粉作為阻斷劑。以下是阻斷步驟:

a. 準(zhǔn)備阻斷緩沖液:在TBST緩沖液中加入適量的阻斷劑(通常為5%脫脂奶粉或1% BSA)。

b. 阻斷操作:將轉(zhuǎn)膜膜放入阻斷緩沖液中,輕輕搖晃,使其完全接觸。

c. 阻斷時(shí)間:通常阻斷操作需要1-2小時(shí),室溫進(jìn)行。

 

六.抗體孵育:

抗體孵育是關(guān)鍵步驟之一,用于特異性結(jié)合目標(biāo)蛋白。以下是抗體孵育步驟:

a. 準(zhǔn)備一次抗體:選擇與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合的一次抗體。

b. 稀釋抗體:根據(jù)供應(yīng)商提供的建議或先前的優(yōu)化實(shí)驗(yàn),將抗體稀釋到適當(dāng)濃度的TBST緩沖液中。

c. 抗體孵育:將轉(zhuǎn)膜膜放入含有稀釋抗體的TBST緩沖液中,使其與目標(biāo)蛋白進(jìn)行特異性結(jié)合。孵育溫度和時(shí)間根據(jù)抗體的要求進(jìn)行設(shè)定。

d. 洗滌:在抗體孵育后,將轉(zhuǎn)膜膜放入TBST緩沖液中進(jìn)行洗滌,去除非特異性結(jié)合的抗體。

 

七.二次抗體結(jié)合及探針檢測(cè):

在經(jīng)過(guò)一次抗體結(jié)合后,通常需要使用與一次抗體相對(duì)應(yīng)的二次抗體進(jìn)行結(jié)合,該二次抗體與一個(gè)酶、熒光染料或放射性標(biāo)記結(jié)合,以提供可檢測(cè)的信號(hào)。

a. 選擇二次抗體:根據(jù)一次抗體的物種來(lái)源,選擇相應(yīng)的二次抗體。

b. 稀釋二次抗體:根據(jù)供應(yīng)商提供的建議或先前的優(yōu)化實(shí)驗(yàn),將二次抗體稀釋到適當(dāng)濃度的TBST緩沖液中。

c. 二次抗體結(jié)合:將轉(zhuǎn)膜膜放入含有稀釋二次抗體的TBST緩沖液中,使其與一次抗體進(jìn)行結(jié)合。

d. 探針檢測(cè):根據(jù)二次抗體的標(biāo)記物,選擇合適的方法進(jìn)行探針檢測(cè)。例如,可以使用酶底物進(jìn)行著色、熒光探針進(jìn)行熒光檢測(cè),或者用放射性探針進(jìn)行放射性測(cè)量。

 

八.圖像獲取及分析:

使用分析系統(tǒng)(如顯影儀、熒光成像儀或放射性顯像系)獲取轉(zhuǎn)膜膜上的圖像,并進(jìn)行后續(xù)的分析。以下是常見(jiàn)的圖像分析步驟:

a. 圖像獲?。簩⑥D(zhuǎn)膜膜放入相應(yīng)的圖像獲取系統(tǒng)中,進(jìn)行圖像記錄。

b. 圖像分析:使用圖像處理軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析,測(cè)量蛋白質(zhì)帶的密度和大小。

c. 定量分析:通過(guò)與適當(dāng)?shù)膬?nèi)部參考蛋白或總蛋白的相對(duì)定量比較,確定目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

 

結(jié)果分析:

1.信號(hào)強(qiáng)度:根據(jù)圖像分析的結(jié)果,觀察目標(biāo)蛋白帶在膜上的信號(hào)強(qiáng)度。較強(qiáng)的信號(hào)表示高蛋白質(zhì)表達(dá),較弱的信號(hào)可能表示低蛋白質(zhì)表達(dá)。

2.分子量大?。和ㄟ^(guò)與分子量標(biāo)記品對(duì)比,在凝膠上的目標(biāo)蛋白帶遷移位置來(lái)估計(jì)其分子量大小。

3.特異性:確保只有目標(biāo)蛋白帶出現(xiàn)信號(hào),而其他非特異性結(jié)合的蛋白不產(chǎn)生信號(hào)。檢查其他帶狀信號(hào)是否與預(yù)期的目標(biāo)蛋白大小和形態(tài)相符。

4.負(fù)對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照:分析實(shí)驗(yàn)中的負(fù)對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果,以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方法的有效性和可靠性。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:使用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法(如t檢驗(yàn)或方差分析)對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,確定差異的顯著性。

需要注意的是,蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)是一種復(fù)雜的技術(shù),結(jié)果分析需要綜合考慮實(shí)驗(yàn)中的多個(gè)因素,并結(jié)合之前的研究背景和目的進(jìn)行解讀,對(duì)于結(jié)果的進(jìn)一步分析和解釋?zhuān)赡苄枰柚渌麑?shí)驗(yàn)或技術(shù)的支持。

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