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(經(jīng)典收藏)高效液相色譜HPLC培訓(xùn)教程
來源:實驗分析知識集中營 時間:2018-05-05 22:39:50 瀏覽:5583次

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(經(jīng)典收藏)高效液相色譜HPLC培訓(xùn)教程

HPLC系統(tǒng)一般由輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、數(shù)據(jù)記錄及處理裝置等組成。其中輸液泵、色譜柱、檢測器是關(guān)鍵部件。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機、自動進樣器、預(yù)柱或保護柱、柱溫控制器等,現(xiàn)代HPLC儀還有微機控制系統(tǒng),進行自動化儀器控制和數(shù)據(jù)處理。制備型HPLC儀還備有自動餾分收集裝置。


    最早的液相色譜儀由粗糙的高壓泵、低效的柱、固定波長的檢測器、繪圖儀,繪出的峰是通過手工測量計算峰面積。后來的高壓泵精度很高并可編程進行梯度洗脫,柱填料從單一品種發(fā)展至幾百種類型,檢測器從單波長至可變波長檢測器、可得三維色譜圖的二極管陣列檢測器、可確證物質(zhì)結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜檢測器。數(shù)據(jù)處理不再用繪圖儀,逐漸取而代之的是最簡單的積分儀、計算機、工作站及網(wǎng)絡(luò)處理系統(tǒng)。


    目前常見的HPLC儀生產(chǎn)廠家國外有Waters公司、Agilent公司(原HP公司)、島津公司等,國內(nèi)有大連依利特公司、上海分析儀器廠、北京分析儀器廠等。

一、輸液泵

1.泵的構(gòu)造和性能

    輸液泵是HPLC系統(tǒng)中最重要的部件之一。泵的性能好壞直接影響到整個系統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果的可靠性。輸液泵應(yīng)具備如下性能:①流量穩(wěn)定,其RSD應(yīng)<0.5%,這對定性定量的準確性至關(guān)重要;②流量范圍寬,分析型應(yīng)在0.1-10 ml/min范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào),制備型應(yīng)能達到100 ml/min;③輸出壓力高,一般應(yīng)能達到150-300kg/cm2;④液缸容積小;⑤密封性能好,耐腐蝕。

   泵的種類很多,按輸液性質(zhì)可分為恒壓泵和恒流泵。恒流泵按結(jié)構(gòu)又可分為螺旋注射泵、柱塞往復(fù)泵和隔膜往復(fù)泵。恒壓泵受柱阻影響,流量不穩(wěn)定;螺旋泵缸體太大,這兩種泵已被淘汰。目前應(yīng)用最多的是柱塞往復(fù)泵。

    柱塞往復(fù)泵的液缸容積小,可至0.1ml,因此易于清洗和更換流動相,特別適合于再循環(huán)和梯度洗脫;改變電機轉(zhuǎn)速能方便地調(diào)節(jié)流量,流量不受柱阻影響;泵壓可達400kg/cm2。其主要缺點是輸出的脈沖性較大,現(xiàn)多采用雙泵系統(tǒng)來克服。雙泵按連接方式可分為并聯(lián)式和串聯(lián)式,一般說來并聯(lián)泵的流量重現(xiàn)性較好(RSD為0.1%左右,串聯(lián)泵為0.2-0.3%),但出故障的機會較多(因多一單向閥),價格也較貴。

2.泵的使用和維護注意事項

    為了延長泵的使用壽命和維持其輸液的穩(wěn)定性,必須按照下列注意事項進行操作:

   ①防止任何固體微粒進入泵體,因為塵?;蚱渌魏坞s質(zhì)微粒都會磨損柱塞、密封環(huán)、缸體和單向閥,因此應(yīng)預(yù)先除去流動相中的任何固體微粒。流動相最好在玻璃容器內(nèi)蒸餾,而常用的方法是濾過,可采用Millipore濾膜(0.2µm或0.45µm)等濾器。泵的入口都應(yīng)連接砂濾棒(或片)。輸液泵的濾器應(yīng)經(jīng)常清洗或更換。

   ②流動相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì),含有緩沖液的流動相不應(yīng)保留在泵內(nèi),尤其是在停泵過夜或更長時間的情況下。如果將含緩沖液的流動相留在泵內(nèi),由于蒸發(fā)或泄漏,甚至只是由于溶液的靜置,就可能析出鹽的微細晶體,這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環(huán)和柱塞等。因此,必須泵入純水將泵充分清洗后,再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護的溶劑(對于反相鍵合硅膠固定相,可以是甲醇或甲醇-水)。

   ③泵工作時要留心防止溶劑瓶內(nèi)的流動相被用完,否則空泵運轉(zhuǎn)也會磨損柱塞、缸體或密封環(huán),最終產(chǎn)生漏液。

   ④輸液泵的工作壓力決不要超過規(guī)定的最高壓力,否則會使高壓密封環(huán)變形,產(chǎn)生漏液。

   ⑤流動相應(yīng)該先脫氣,以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡,影響流量的穩(wěn)定性,如果有大量氣泡,泵就無法正常工作。

如果輸液泵產(chǎn)生故障,須查明原因,采取相應(yīng)措施排除故障:

   ①沒有流動相流出,又無壓力指示。原因可能是泵內(nèi)有大量氣體,這時可打開泄壓閥,使泵在較大流量(如5ml/min)下運轉(zhuǎn),將氣泡排盡,也可用一個50ml針筒在泵出口處幫助抽出氣體。另一個可能原因是密封環(huán)磨損,需更換。

   ②壓力和流量不穩(wěn)。原因可能是氣泡,需要排除;或者是單向閥內(nèi)有異物,可卸下單向閥,浸入丙酮內(nèi)超聲清洗。有時可能是砂濾棒內(nèi)有氣泡,或被鹽的微細晶?;蜃躺奈⑸锊糠侄氯?,這時,可卸下砂濾棒浸入流動相內(nèi)超聲除氣泡,或?qū)⑸盀V棒浸入稀酸(如4mol/L硝酸)內(nèi)迅速除去微生物,或?qū)Ⅺ}溶解,再立即清洗。

   ③壓力過高的原因是管路被堵塞,需要清除和清洗。壓力降低的原因則可能是管路有泄漏。檢查堵塞或泄漏時應(yīng)逐段進行。

3.梯度洗脫

   HPLC有等強度(isocratic)和梯度(gradient)洗脫兩種方式。等度洗脫是在同一分析周期內(nèi)流動相組成保持恒定,適合于組分數(shù)目較少,性質(zhì)差別不大的樣品。梯度洗脫是在一個分析周期內(nèi)程序控制流動相的組成,如溶劑的極性、離子強度和pH值等,用于分析組分數(shù)目多、性質(zhì)差異較大的復(fù)雜樣品。采用梯度洗脫可以縮短分析時間,提高分離度,改善峰形,提高檢測靈敏度,但是常常引起基線漂移和降低重現(xiàn)性。

   梯度洗脫有兩種實現(xiàn)方式:低壓梯度(外梯度)和高壓梯度(內(nèi)梯度)。

    兩種溶劑組成的梯度洗脫可按任意程度混合,即有多種洗脫曲線:線性梯度、凹形梯度、凸形梯度和階梯形梯度。線性梯度最常用,尤其適合于在反相柱上進行梯度洗脫。

    在進行梯度洗脫時,由于多種溶劑混合,而且組成不斷變化,因此帶來一些特殊問題,必須充分重視:

   ①要注意溶劑的互溶性,不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相。有些溶劑在一定比例內(nèi)混溶,超出范圍后就不互溶,使用時更要引起注意。當有機溶劑和緩沖液混合時,還可能析出鹽的晶體,尤其使用磷酸鹽時需特別小心。

   ②梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高,以保證良好的重現(xiàn)性。進行樣品分析前必須進行空白梯度洗脫,以辨認溶劑雜質(zhì)峰,因為弱溶劑中的雜質(zhì)富集在色譜柱頭后會被強溶劑洗脫下來。用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣,以防止混合時產(chǎn)生氣泡。

   ③混合溶劑的粘度常隨組成而變化,因而在梯度洗脫時常出現(xiàn)壓力的變化。例如甲醇和水粘度都較小,當二者以相近比例混合時粘度增大很多,此時的柱壓大約是甲醇或水為流動相時的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱能承受的最大壓力。

   ④每次梯度洗脫之后必須對色譜柱進行再生處理,使其恢復(fù)到初始狀態(tài)。需讓10~30倍柱容積的初始流動相流經(jīng)色譜柱,使固定相與初始流動相達到完全平衡。

二、進樣器

    早期使用隔膜和停流進樣器,裝在色譜柱入口處?,F(xiàn)在大都使用六通進樣閥或自動進樣器。進樣裝置要求:密封性好,死體積小,重復(fù)性好,保證中心進樣,進樣時對色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。HPLC進樣方式可分為:隔膜進樣、停流進樣、閥進樣、自動進樣。

1.隔膜進樣。用微量注射器將樣品注入專門設(shè)計的與色譜柱相連的進樣頭內(nèi),可把樣品直接送到柱頭填充床的中心,死體積幾乎等于零,可以獲得最佳的柱效,且價格便宜,操作方便。但不能在高壓下使用(如10MPa以上);此外隔膜容易吸附樣品產(chǎn)生記憶效應(yīng),使進樣重復(fù)性只能達到1-2%;加之能耐各種溶劑的橡皮不易找到,常規(guī)分析使用受到限制。

2.停流進樣。可避免在高壓下進樣。但在HPLC中由于隔膜的污染,停泵或重新啟動時往往會出現(xiàn)"鬼峰";另一缺點是保留時間不準。在以峰的始末信號控制餾分收集的制備色譜中,效果較好。

3.閥進樣。一般HPLC分析常用六通進樣閥(以美國Rheodyne公司的7725和7725i型最常見),其關(guān)鍵部件由圓形密封墊(轉(zhuǎn)子)和固定底座(定子)組成。由于閥接頭和連接管死體積的存在,柱效率低于隔膜進樣(約下降5-10%左右),但耐高壓(35-40MPa),進樣量準確,重復(fù)性好(0.5%),操作方便。

    六通閥的進樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。①用部分裝液法進樣時,進樣量應(yīng)不大于定量環(huán)體積的50%(最多75%),并要求每次進樣體積準確、相同。此法進樣的準確度和重復(fù)性決定于注射器取樣的熟練程度,而且易產(chǎn)生由進樣引起的峰展寬。②用完全裝液法進樣時,進樣量應(yīng)不小于定量環(huán)體積的5-10倍(最少3倍),這樣才能完全置換定量環(huán)內(nèi)的流動相,消除管壁效應(yīng),確保進樣的準確度及重復(fù)性。

    六通閥使用和維護注意事項:①樣品溶液進樣前必須0.45&micron濾膜過濾,以減少微粒對進樣閥的磨損。②轉(zhuǎn)動閥芯時不能太慢,更不能停留在中間位置,否則流動相受阻,使泵內(nèi)壓力劇增,甚至超過泵的最大壓力;再轉(zhuǎn)到進樣位時,過高的壓力將使柱頭損壞。③為防止緩沖鹽和樣品殘留在進樣閥中,每次分析結(jié)束后應(yīng)沖洗進樣閥。通常可用水沖洗,或先用能溶解樣品的溶劑沖洗,再用水沖洗。

4.自動進樣。用于大量樣品的常規(guī)分析。

三、色譜柱

    色譜是一種分離分析手段,分離是核心,因此擔負分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好,分析速度快等。市售的用于HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、氧化鋁、有機聚合物微球(包括離子交換樹脂)、多孔碳等,其粒度一般為3,5,7,10μm等,柱效理論值可達5-16萬/米。對于一般的分析只需5000塔板數(shù)的柱效;對于同系物分析,只要500即可;對于較難分離物質(zhì)對則可采用高達2萬的柱子,因此一般10-30cm左右的柱長就能滿足復(fù)雜混合物分析的需要。

    柱效受柱內(nèi)外因素影響,為使色譜柱達到最佳效率,除柱外死體積要小外,還要有合理的柱結(jié)構(gòu)(盡可能減少填充床以外的死體積)及裝填技術(shù)。即使最好的裝填技術(shù),在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的,靠近管壁的部位比較疏松,易產(chǎn)生溝流,流速較快,影響沖洗劑的流形,使譜帶加寬,這就是管壁效應(yīng)。這種管壁區(qū)大約是從管壁向內(nèi)算起30倍粒徑的厚度。在一般的液相色譜系統(tǒng)中,柱外效應(yīng)對柱效的影響遠遠大于管壁效應(yīng)。

1.柱的構(gòu)造

    色譜柱由柱管、壓帽、卡套(密封環(huán))、篩板(濾片)、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成,壓力不高于70 kg/cm2時,也可采用厚壁玻璃或石英管,管內(nèi)壁要求有很高的光潔度。為提高柱效,減小管壁效應(yīng),不銹鋼柱內(nèi)壁多經(jīng)過拋光。也有人在不銹鋼柱內(nèi)壁涂敷氟塑料以提高內(nèi)壁的光潔度,其效果與拋光相同。還有使用熔融硅或玻璃襯里的,用于細管柱。色譜柱兩端的柱接頭內(nèi)裝有篩板,是燒結(jié)不銹鋼或鈦合金,孔徑0.2-20&micron;(5-10&micron),取決于填料粒度,目的是防止填料漏出。

    色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類,尺寸規(guī)格也不同:①常規(guī)分析柱(常量柱),內(nèi)徑2-5mm(常用4.6mm,國內(nèi)有4mm和5mm),柱長10-30cm;②窄徑柱(narrowbore,又稱細管徑柱、半微柱semi-microcolumn),內(nèi)徑1-2mm,柱長10-20cm;③毛細管柱(又稱微柱microcolumn),內(nèi)徑0.2-0.5mm;④半制備柱,內(nèi)徑>5mm;⑤實驗室制備柱,內(nèi)徑20~40mm,柱長10-30cm;⑥生產(chǎn)制備柱內(nèi)徑可達幾十厘米。柱內(nèi)徑一般是根據(jù)柱長、填料粒徑和折合流速來確定,目的是為了避免管壁效應(yīng)。

2.柱的發(fā)展方向

    因強調(diào)分析速度而發(fā)展出短柱,柱長3-10cm,填料粒徑2-3&micron。為提高分析靈敏度,與質(zhì)譜(MS)聯(lián)接,而發(fā)展出窄徑柱、毛細管柱和內(nèi)徑小于0.2mm的微徑柱(microbore)。細管徑柱的優(yōu)點是:①節(jié)省流動相;②靈敏度增加;③樣品量少;④能使用長柱達到高分離度;⑤容易控制柱溫;⑥易于實現(xiàn)LC-MS聯(lián)用。

    但由于柱體積越來越小,柱外效應(yīng)的影響就更加顯著,需要更小池體積的檢測器(甚至采用柱上檢測),更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設(shè)備應(yīng)具備如下性能:輸液泵能精密輸出1-100µl/min的低流量,進樣閥能準確、重復(fù)地進樣微小體積的樣品。且因上樣量小,要求高靈敏度的檢測器,電化學檢測器和質(zhì)譜儀在這方面具有突出優(yōu)點。

3.柱的填充和性能評價

    色譜柱的性能除了與固定相性能有關(guān)外,還與填充技術(shù)有關(guān)。在正常條件下,填料粒度>20&micron時,干法填充制備柱較為合適;顆粒<20&micron時,濕法填充較為理想。填充方法一般有4種:①高壓勻漿法,多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充;②徑向加壓法,Waters專利;③軸向加壓法,主要用于裝填大直徑柱;④干法。柱填充的技術(shù)性很強,大多數(shù)實驗室使用已填充好的商品柱。

    必須指出,高效液相色譜柱的獲得,裝填技術(shù)是重要環(huán)節(jié),但根本問題還在于填料本身性能的優(yōu)劣,以及配套的色譜儀系統(tǒng)的的結(jié)構(gòu)是否合理。

    無論是自己裝填的還是購買的色譜柱,使用前都要對其性能進行考察,使用期間或放置一段時間后也要重新檢查。柱性能指標包括在一定實驗條件下(樣品、流動相、流速、溫度)下的柱壓、理論塔板高度和塔板數(shù)、對稱因子、容量因子和選擇性因子的重復(fù)性,或分離度。一般說來容量因子和選擇性因子的重復(fù)性在±5%或±10%以內(nèi)。進行柱效比較時,還要注意柱外效應(yīng)是否有變化。

    一份合格的色譜柱評價報告應(yīng)給出柱的基本參數(shù),如柱長、內(nèi)徑、填料的種類、粒度、色譜柱的柱效、不對稱度和柱壓降等。

4.柱的使用和維護注意事項

    色譜柱的正確使用和維護十分重要,稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中,需要注意下列問題,以維護色譜柱。

   ① 避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內(nèi)的填充狀況;柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內(nèi)填料,因此在調(diào)節(jié)流速時應(yīng)該緩慢進行,在閥進樣時閥的轉(zhuǎn)動不能過緩(如前所述)。

   ② 應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成,特別是反相色譜中,不應(yīng)直接從有機溶劑改變?yōu)槿渴撬?,反之亦然?/span>

   ③ 一般說來色譜柱不能反沖,只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時,才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會迅速降低柱效。

   ④ 選擇使用適宜的流動相(尤其是pH),以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一預(yù)柱,分析柱是鍵合硅膠時,預(yù)柱為硅膠,可使流動相在進入分析柱之前預(yù)先被硅膠"飽和",避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。

   ⑤ 避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi),需要對樣品進行預(yù)處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。

   ⑥ 經(jīng)常用強溶劑沖洗色譜柱,清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進行清洗時,對流路系統(tǒng)中流動相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡,每種流動相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右,即常規(guī)分析需要50-75ml。

    下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序,作為參考:硅膠柱以正已烷(或庚烷)、二氯甲烷和甲醇依次沖洗,然后再以相反順序依次沖洗,所有溶劑都必須嚴格脫水。甲醇能洗去殘留的強極性雜質(zhì),已烷使硅膠表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷(或氯仿)依次沖洗,再以相反順序依次沖洗。如果下一步分析用的流動相不含緩沖液,那么可以省略最后用水沖洗這一步。一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質(zhì),在甲醇(乙腈)沖洗時重復(fù)注射100-200µ四氫呋喃數(shù)次有助于除去強疏水性雜質(zhì)。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類脂。有時也注射二甲亞砜數(shù)次。此外,用乙腈、丙酮和三氟醋酸(0.1%)梯度洗脫能除去蛋白質(zhì)污染。

    陽離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗,陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗,除去交換性能強的鹽,然后用水、甲醇、二氯甲烷(除去吸附在固定相表面的有機物)、甲醇、水依次沖洗。

   ⑦ 保存色譜柱時應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇,柱接頭要擰緊,防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長時間。

   ⑧ 色譜柱使用過程中,如果壓力升高,一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞,這時應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M行清洗;另一種可能是大分子進入柱內(nèi),使柱頭被污染;如果柱效降低或色譜峰變形,則可能柱頭出現(xiàn)塌陷,死體積增大。
在后兩種情況發(fā)生時,小心擰開柱接頭,用潔凈小鋼將柱頭填料取出1-2mm高度(注意把被污染填料取凈)再把柱內(nèi)填料整平。然后用適當溶劑濕潤的固定相(與柱內(nèi)相同)填滿色譜柱,壓平,再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到改善,但是很難恢復(fù)到新柱的水平。

    柱子失效通常是柱端部分,在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱(5-30mm),可以起到保護、延長柱壽命的作用。采用保護柱會損失一定的柱效,這是值得的。

    通常色譜柱壽命在正確使用時可達2年以上。以硅膠為基質(zhì)的填料,只能在pH2-9范圍內(nèi)使用。柱子使用一段時間后,可能有一些吸附作用強的物質(zhì)保留于柱頂,特別是一些有色物質(zhì)更易看清被吸著在柱頂?shù)奶盍仙?。新的色譜柱在使用一段時間后柱頂填料可能塌陷,使柱效下降,這時也可補加填料使柱效恢復(fù)。

   每次工作完后,最好用洗脫能力強的洗脫液沖洗,例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當采用鹽緩沖溶液作流動相時,使用完后應(yīng)用無鹽流動相沖洗。含鹵族元素(氟、氯、溴)的化合物可能會腐蝕不銹鋼管道,不宜長期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經(jīng)常使用,應(yīng)每隔4-5天開機沖洗15分鐘。


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全部 3小時前 四川
文字是人類用符號記錄表達信息以傳之久遠的方式和工具?,F(xiàn)代文字大多是記錄語言的工具。人類往往先有口頭的語言后產(chǎn)生書面文字,很多小語種,有語言但沒有文字。文字的不同體現(xiàn)了國家和民族的書面表達的方式和思維不同。文字使人類進入有歷史記錄的文明社會。
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